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液相方法開發(fā)攻略 - 彈：實(shí)現(xiàn)保留

液相方法開發(fā)攻略

彈：實(shí)現(xiàn)保留

今天要為大家?guī)硪粋€(gè)新干貨系列——液相方法開發(fā)攻略！

在進(jìn)行液相色譜分析時(shí)，我們通常有以下訴求：

而在液相分析工作中，液相方法的開發(fā)一直是一項(xiàng)比較具有難度的工作，不論是新手小白，還是有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室老師，在面對(duì)新項(xiàng)目的方法開發(fā)時(shí)，總會(huì)遇到一些問題。

因此，YoYo特意把大曹三耀技術(shù)中心多年來積累總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)，梳理匯總為這一系列液相方法開發(fā)攻略，并將圍繞以下四個(gè)方面展開介紹：

★ 實(shí)現(xiàn)保留

★ 實(shí)現(xiàn)分離

★ 峰形和理論塔板數(shù)

★ 壽命

今天先來介紹重要也是關(guān)鍵的彈——實(shí)現(xiàn)保留，后續(xù)幾篇將在今后陸續(xù)推送，敬請(qǐng)期待喲~

由于大部分化合物都可以在反相分析模式下，使用反相C18色譜柱進(jìn)行分析與保留，因此，在建立新方法時(shí)，反相C18色譜柱也是優(yōu)先選擇的色譜柱。一般可以按照以下步驟進(jìn)行調(diào)整：

反相C18柱初篩 看是否有保留

提問：方法初篩時(shí)，選擇什么樣的C18色譜柱比較好？

YoYo老師：選擇一款普適型色譜柱，要求硅膠純度高、金屬雜質(zhì)低、具有適中的疏水性與表面極性，能分析大多數(shù)常規(guī)化合物，峰形好、壽命長，分離度高，柱效高~

這些要求很過分嗎？不！

這是我們對(duì)CAPCELL PAK C18 MGII色譜柱的基本要求！

CAPCELL PAK C18 MGII

CAPCELL PAK C18 MG系列色譜柱憑借填料表面致密的聚合物包被技術(shù)，極大程度地抑制了硅膠基材的金屬雜質(zhì)及殘留硅醇基等不良影響，CAPCELL PAK系列色譜柱具有以下特長：

★ 極大限度地減少配位化合物的吸附

★ 極大限度地抑制殘留硅醇基的二次效應(yīng)

★ *的耐酸、耐堿性能

★ 能得到對(duì)稱性良好的色譜峰

★ 具備良好的保留與分離能力

其中，CAPCELL PAK C18 MGII色譜柱是普適性很強(qiáng)的C18色譜柱，可以滿足大部分化合物的分析需求。

那么，在經(jīng)過C18色譜柱初篩之后，還是發(fā)生了保留不充分的情況，應(yīng)該如何調(diào)整分析方法來實(shí)現(xiàn)保留呢？

1

調(diào)整pH值

在反相模式下，對(duì)于不同性質(zhì)的化合物也應(yīng)采取不同的流動(dòng)相條件及相應(yīng)色譜柱。例如，酸性化合物在酸性條件下保留較強(qiáng)，堿性化合物在堿性條件下保留較強(qiáng)，利用這一性質(zhì)，調(diào)整適合的pH值，并選擇相應(yīng)適合的色譜柱，即可達(dá)到良好保留結(jié)果。

在設(shè)定流動(dòng)相pH時(shí)需要注意：離子性化合物可能會(huì)由于流動(dòng)相pH值設(shè)定的不合理而發(fā)生漂移，建議將流動(dòng)相的pH值設(shè)定在化合物的pKa±2以上范圍。

2

更換保留模式

如果調(diào)整流動(dòng)相pH也不能解決保留問題，該化合物可能不適合在反相模式下進(jìn)行保留和分析，這時(shí)，可以考慮更換保留模式進(jìn)行進(jìn)一步的方法摸索。

★ 離子交換模式（離子對(duì)試劑、離子交換柱）

★ HILIC模式

★ 正相模式

色譜柱的選擇

對(duì)于強(qiáng)極性、小分子類化合物，可以使用高極性反相柱或在HILIC模式下進(jìn)行保留嘗試

★ 高極性反相柱：AQ、ADME

★ HILIC（親水性相互作用）柱：PC HILIC、NH2、SILICA

對(duì)于酸性化合物，可以使用陰離子交換柱或反相柱+正離子對(duì)試劑的方法，使酸性化合物處于分子態(tài)，利于增強(qiáng)保留

★ 陰離子交換柱：NH2

★ 反相柱+正離子對(duì)試劑：C18 MG、C18 MGII、SPOLAR C18

對(duì)于堿性化合物和兩性化合物，可以嘗試使用陽離子交換柱或反相柱+負(fù)離子對(duì)試劑的方法，使堿性化合物處于分子態(tài)，增強(qiáng)保留

★ 陽離子交換柱：SCX、CR

★ 反相柱+負(fù)離子對(duì)試劑：C18 MG、C18 MGII、SPOLAR C18

分離模式選擇例

接下來，YoYo將以三聚氰胺的分析為例，對(duì)保留困難的化合物的方法建立進(jìn)行說明。

三聚氰胺俗稱蜜胺、蛋白精，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，為重要的氮雜環(huán)有機(jī)化工原料，有毒，不可用作食品加工和食品添加劑，pKa=8，屬于弱堿性化合物。

三聚氰胺

Melamine

M.W. :126.12

（一）離子交換模式

在離子交換模式下進(jìn)行分析，能對(duì)三聚氰胺得到良好保留。具體做法可分為以下兩種：

1. 反相色譜柱 + 離子對(duì)試劑

▲CAPCELL PAK C18 MG+離子對(duì)試劑

HPLC Conditions (Refer to GB/T 22388-2008):

Column: CAPCELL PAK C18 MG S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm

M.Phase: 10 mM citric acid, 10mM SOS (pH 3.0 adjusted with NaOH) / CH3CN = 90 / 10

Flow rate: 1 mL/min

Oven Temp.:  40°C

Detector:  UV 240 nm

Sample:   Melamine in M.P.

Inj. Vol.:  20 μL

2. 離子交換色譜柱分析

▲CAPCELL PAK SCX色譜柱

HPLC Conditions:

Column:  CAPCELL PAK SCX UG80 S5; 4.6 mm i.d. × 150 mm

M.Phase: 50 mM KH2PO4 (pH 3.0 adjusted with H3PO4) / CH3CN = 70 / 30

Flow rate: 1 mL/min

Oven Temp.:  30°C

Detector:  UV 240 nm

Sample:   Melamine in M.P.

Inj. Vol.:  20 μL

CAPCELL PAK SCX

CAPCELL PAK SCX是一款解決了傳統(tǒng)硅膠系離子交換柱存在的問題的聚合物包被型強(qiáng)陽離子交換色譜柱。在精密分級(jí)的5 μm的高純度硅膠上形成高分子聚合物包被后，導(dǎo)入磺酸基。聚合物包被型的Si-C結(jié)合比一般的化學(xué)結(jié)合型硅膠系SCX的Si-O-Si結(jié)合更穩(wěn)定，耐久性更強(qiáng)。

★ 通過強(qiáng)陽離子交換作用和疏水性相互作用的共同保留機(jī)制來進(jìn)行保留

★ 批次間重現(xiàn)性良好

★ 耐久性強(qiáng)

不論是反相柱+離子對(duì)試劑，還是使用離子交換色譜柱進(jìn)行分析，都會(huì)發(fā)現(xiàn)色譜柱平衡時(shí)間對(duì)保留時(shí)間的影響。在離子交換模式下進(jìn)行分析時(shí)，需要充分平衡色譜柱，建議小流速過夜平衡，可以得到比較穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

（二）高極性反相色譜柱

鍵合金剛烷基團(tuán)的CAPCELL PAK ADME色譜柱，兼具高表面極性和一定的疏水性，不僅適用于強(qiáng)極性物質(zhì)的保留，也適用于強(qiáng)極性物質(zhì)和疏水性物質(zhì)的多組分共同分析。

使用鍵合*金剛烷基團(tuán)的CAPCELL PAK ADME色譜柱，在簡單的2%甲醇條件下即可實(shí)現(xiàn)三聚氰胺和雙氰胺的良好保留與分離。這得益于ADME色譜柱*的表面極性與保留模式。

▲CAPCELL PAK ADME分析三聚氰胺與雙氰胺結(jié)果

*峰1：雙氰胺，峰2：三聚氰胺

HPLC Conditions:

色譜柱：CAPCELL PAK ADME S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm

流動(dòng)相：2% CH3OH

流　速：1000µL / min

溫　度：35°C

檢　測：PDA210 nm

進(jìn)樣量：5 µL

樣　品：10 μg/mL（流動(dòng)相溶解稀釋）

CAPCELL PAK ADME

CAPCELL PAK ADME色譜柱采用*的立體籠狀金剛烷基官能團(tuán)——ADME官能團(tuán)，突破了以C18官能團(tuán)為主的傳統(tǒng)柱在反相保留機(jī)理中的可分析化合物的限制，使可分析化合物的極性范圍得到了巨大的提升；并且，在極性提升的同時(shí)還兼顧一定的疏水性；從而，包含從強(qiáng)極性化合物到疏水性化合物的復(fù)雜組分樣品在ADME上也能同時(shí)得到良好的保留。

★ 立體籠狀金剛烷基官能團(tuán)——*的*的表面極性與疏水性平衡

★ 高表面極性——對(duì)強(qiáng)極性化合物的良好保留

★ 兼顧一定疏水性——從極性到疏水性化合物的共同分析

★ 立體選擇性——空間異構(gòu)體拆分能力

ADME(adamantane)金剛烷，我們將這種籠狀結(jié)構(gòu)的金剛烷基團(tuán)以控制的鍵合密度導(dǎo)入填料表面，通過“新型官能團(tuán)”和*的包被型填料表面“控制技術(shù)”，我們將保持疏水性又提高表面極性變?yōu)榭赡?；由于金剛?的籠狀結(jié)構(gòu)所帶來的立體選擇性，還賦予了ADME分離結(jié)構(gòu)類似化合物的能力。

（三）親水性相互作用 HILIC模式

親水性相互作用色譜法（HILIC）是針對(duì)在常規(guī)C18色譜柱上保留較弱的強(qiáng)親水性物質(zhì)的保留方法。在HILIC模式下，通過鍵合極性官能團(tuán)的固定相與反相模式常用的CH3CN / H2O系流動(dòng)相條件相組合，對(duì)親水性化合物進(jìn)行保留與分離。因此，HILIC是在HPLC的分離模式中常使用的反相模式的反相，故也被稱為“反反相模式”。

大阪曹達(dá)獨(dú)立研發(fā)合成了構(gòu)成細(xì)胞膜的主要磷脂類物質(zhì)之一的卵磷脂親水性部位——PC基團(tuán)（磷酸膽堿基團(tuán)），作為PC HILIC色譜柱的官能團(tuán)，對(duì)親水性化合物的保留具有優(yōu)勢。

如下圖，使用PC HILIC色譜柱和另一款其他品牌色譜柱Column B進(jìn)行對(duì)比，對(duì)三聚氰胺進(jìn)行分析，在10 mmol/L HCOONH4, CH3CN / H2O = 90 / 10（pH = 3.0）條件下，PC HILIC色譜柱所得保留時(shí)間更長，理論塔板數(shù)更高，即使是在水相比例為20%時(shí)，也得到了足夠的保留。

▲PC HILIC色譜柱在不同條件下分析結(jié)果

HPLC Conditions：

Column   : PC HILIC 4.6 mm i.d. x 250 mm

Mobile phase  : 10 mmol/L HCOONH4, CH3CN / H2O = 90 / 10, pH = 3.0

Flow rate  : 1.0 mL/min

Temperature  : 40 ?C

Detection  : UV 235 nm

Inj. vol.  : 10 μL

Sample dissolved in: Mobile phase

PC HILIC

大阪曹達(dá)獨(dú)立研發(fā)合成了構(gòu)成細(xì)胞膜的主要磷脂類物質(zhì)之一的卵磷脂親水性部位——PC基團(tuán)（磷酸膽堿基團(tuán)），作為PC HILIC色譜柱的官能團(tuán)，對(duì)親水性化合物的保留具有優(yōu)勢。

★使用超親水性的磷酸膽堿基團(tuán)作為官能團(tuán)的HILIC色譜柱

★隨乙腈含量增加，保留增大，通常70%乙腈

（四）LC-MS分析——混合模式保留

MS檢測對(duì)流動(dòng)相的要求：

★ 不含離子對(duì)試劑

★ 揮發(fā)性鹽，低濃度

陽離子交換填料柱 + 揮發(fā)性鹽溶液（低濃度）

SCX + C18 = CR ！

在以MS檢測器進(jìn)行分析時(shí)，流動(dòng)相條件會(huì)對(duì)靈敏度產(chǎn)生很大影響，CAPCELL PAK CR色譜柱混合了C18和強(qiáng)陽離子交換SCX填料，即使對(duì)多種堿性化合物進(jìn)行同時(shí)分析，也能兼顧對(duì)保留和MS檢測靈敏度的要求。

如上圖，在中性條件下：

● C18色譜柱：中性化合物得到保留，酸性、堿性化合物快速出峰；

● SCX色譜柱：堿性化合物得到保留，中性、酸性化合物快速出峰；

● 混合了兩種填料的CR色譜柱：堿性化合物得到保留，中性化合物能得到適度保留，酸性化合物依然快速出峰。

此時(shí)，只需將流動(dòng)相條件調(diào)整為酸性，即可在CR色譜柱上同時(shí)保留這三種類型的化合物：

HPLC Conditions：

Column  ：CAPCELL PAK CR S5 1:4 ; 2.0 mm i.d. × 150 mm

Mobile Phase：1.0 vol% CH3COOH,

25 mmol/L CH3COONH4 / CH3CN = 50 / 50

Flow rate  ：200 µL/min

Temp  ：40 ℃

Detection  ：UV 240 nm

Injection  ：2 µL

Sample  ：10 µg/mL

CAPCELL PAK CR

CAPCELL PAK CR色譜柱是一款混合C18和強(qiáng)陽離子交換SCX填料的色譜柱。對(duì)多種堿性化合物進(jìn)行同時(shí)分析時(shí)，能同時(shí)兼顧對(duì)保留和MS檢測靈敏度的要求。

★ 強(qiáng)陽離子交換SCX與C18混合填料

★ 具有*分離模式

★ 適合于LC-MS的高靈敏度離子化合物分析

★ 可對(duì)酸性、中性、堿性化合物進(jìn)行同時(shí)保留

★ 有3種混合比例可供選擇

 *與武田制藥共同開發(fā)

通過調(diào)整流動(dòng)相的鹽濃度，可在離子交換作用下針對(duì)堿性化合物的保留程度進(jìn)行調(diào)整，從而改變分離模式，達(dá)到不同極性化合物同時(shí)分析的效果。